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[细小] 猪病毒性腹泻的流行特点、疫苗及临床防控效果

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猪客_2 发表于 2018-4-14 16:20
病毒性腹泻的病原学和流行病学



1.1 病原

猪腹泻一直是困扰我国乃至全球养猪业的重要疾病。2010年底,大规模、严重猪腹泻在我国南方地区各养殖场暴发,此次大规模的猪腹泻主要表现为哺乳仔猪,特别是1周龄内仔猪的水样腹泻、呕吐、脱水等症状,发病率和死亡率可达80%~100%,后备母猪、经产母猪、公猪及育肥猪等主要表现为一过性水样腹泻。随后,该病迅速扩散至国内各养猪省份。

2013年4月,该病首次在北美大陆暴发,并造成了超过800万头仔猪的死亡和严重的经济损失。目前,该病在北美洲、亚洲及欧洲等地区的主要养猪国家均有报道。腹泻是一种症状或症候群,而不是一种单一的疾病。造成腹泻的原因非常复杂,包括传染性和非传染性因素。传染性因素包括病毒、细菌和寄生虫感染,非传染性因素则包括饲料营养、断奶应激、寒冷、潮湿等卫生条件。病毒和细菌是引起腹泻的常见原因,其中又以病毒性腹泻造成的危害相对更普遍、更严重。

研究表明,2010年以来的这一波腹泻为病毒性病原导致的,以猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) 感染为主,超过60%的腹泻样品中可检出PEDV;传染性胃肠炎病毒(transmissible gastraenteritis virus, TGEV)和轮状病毒(porcine rotavirus, PoRV)等腹泻相关病毒也单独或多重混合感染而存在于腹泻猪群中,但两者的检出率相对较低,分别在0%~32%和0%~25%之间。

此外,一种新的与腹泻相关的病毒——猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)从中国大陆多个省份腹泻猪群中被检出,检出率在6.51%~31%,是检出率仅次于PEDV的腹泻病原。

1.2 流行特点

由于流行病原谱从原来的PEDV、TGEV和轮状病毒为主要病原转变为由PEDV和PDCoV为主要病原,导致此次腹泻流行情况与以往的流行病学和传统认识存在较大差异。针对PEDV的研究也表明,当前流行毒株的遗传和抗原性等均发生了变异。进化树分析表明,当前主要流行PEDV毒株与主要疫苗毒株CV777处于不同的进化分支。

2010年后鉴定的PEDV中国毒株的S基因表现出了新的变异特征,与CV777毒株S基因核苷酸的同源性仅为89%~92%;而与2013年以来鉴定的美国PEDV毒株S基因氨基酸的同源性为93%~99%。进化树分析显示,2010年后的毒株与之前的毒株全基因组及S基因(蛋白)出现明显的分支。主要突变存在于S1基因区域及抗原位点COE(CO-26K equivalent)中的中和表位区域。CV777强毒株在S蛋白549及594位点其氨基酸为苏氨酸和甘氨酸,而2010年后毒株在这两个位点上的氨基酸均为丝氨酸,2002~2009年毒株在549位点为精氨酸或丝氨酸,594位点为丝氨酸。

研究人员还发现了S基因大量缺失的毒株,在2008年从韩国猪群中发现了一株缺失了204个氨基酸(aa713-aa916)的临床毒株,还有学者在2013年美国暴发腹泻的猪群中检测到了一株在S1基因缺失了197个氨基酸的临床毒株。这些基因组中的变异及缺失也许是导致当前流行毒株的致病性与2010年前毒株不同的原因,也可能是造成当前CV777毒株的疫苗免疫后不能有效地保护猪群而导致PED暴发的重要原因。

新现的PDCoV属于冠状病毒科中一个新的属——丁型冠状病毒属(genus deltacoronavirus),是唯一一种感染非禽类的丁型冠状病毒。该病毒最早是香港学者从猪粪便拭子样品中检测到。2014年美国学者从暴发腹泻的猪群样品中检出并成功分离,新生猪和新生商品仔猪攻毒试验均表明该病毒可以导致新生仔猪PED、TGE样腹泻。临床调查结果也证实了PDCoV可引起各阶段猪只腹泻,但主要以新生哺乳仔猪腹泻为主;该病毒可单独或与PEDV混合感染而存在。

1.3 传染流行特点

猪病毒性腹泻是独立的猪急性接触性肠道传染病,发病猪和带毒猪是主要的传染源,感染后的康复猪也可作为中间传播宿主进行病毒传播;同时,被病毒污染的周围环境,如运输车辆、饲料、饮水、饲养员的衣服和鞋、用具等都可散播传染。腹泻病毒主要经消化道传播,粪——口传播是主要的传播途径,但有人报道还可以通过乳汁、呼吸道等途径传播。研究表明,腹泻或带毒母猪在产后可通过粪便排毒,且排毒周期较长,可长达1个月。

目前,我国各年龄阶段的猪只都能感染发病,其中哺乳仔猪、保育猪和育肥猪是易感染猪群。新生哺乳仔猪与哺乳母猪在同一个环境下生活,非常容易接触到病毒,且仔猪免疫系统发育不完善,无主动免疫保护,如果母乳中无足够的保护性抗体或仔猪无法吸吮到母乳则非常容易发病。在临床上,较容易观察到新生仔猪,特别是1周龄内仔猪发病率和死亡率非常高;随着仔猪日龄增加,其抵抗力也增强,发病率和死亡率呈下降趋势。另外,有报道显示感染了其他病原,如猪圆环病毒2型、猪蓝耳病病毒等会加重感染PEDV后的症状和病变。

2 腹泻疫苗及免疫机理截止2018年1月,国内共有22家企业获得了29个腹泻疫苗批准文号。其中有流行性腹泻、传染性胃肠炎病毒二联灭活疫苗,猪流行性腹泻、传染性胃肠炎病毒二联弱毒苗,猪流行性腹泻、传染性胃肠炎和轮状病毒三联灭活苗及猪流行性腹泻、传染性胃肠炎和轮状病毒三联弱毒苗。

2.1 灭活疫苗

早期国内的灭活苗生产采用给仔猪口服强毒,待仔猪出现水样腹泻时剖杀取肠内容物和黏膜,加入甲醛灭活后用氢氧化铝佐剂制备成乳剂。自1988年通过添加胰酶的方法在Vero细胞上成功分离出PEDV后,多种二联及三联疫苗研制成功并上市。以低代次PEDV CV777与TGEV华毒株制备的TGE-PED二联灭活苗和PED-TGE-RoV三联灭活苗使用的时间长,推广面积大。最近两年有基于中国PEDV新毒株ZJ08株以及2010年后变异毒株AJ1102株研制的PED-TGE二联灭活苗上市和使用。至此,在生产实践中有基于CV777毒株和新毒株(ZJ08和AJ1102)PEDV疫苗的选择,且新毒株疫苗的使用比例呈现增加的趋势。

灭活苗以其安全性高、易于运输和保存的特点,在动物疫病防控方面发挥了非常重要的作用。后海穴或颈部肌肉注射是灭活苗的免疫途径,机体血液中产生的中和抗体类型主要为IgG,可保护病毒的全身感染。仔猪出生后通过吸吮母乳获得免疫抗体,主要为IgG,也有少量的IgA。抗体通过肠上皮进入血液循环,从而被动获得抵抗全身感染(非肠内感染)的免疫力。此外,灭活苗的单次免疫剂量大,通常每次需注射107.0TCID50/mL,且需要免疫2次及以上才能刺激产生较高水平的中和抗体。

但随着PEDV在体外细胞培养技术的不断改进,抗原含量的瓶颈得到了解决。目前,市售活苗中的抗原含量达到了107.0TCID50/mL,最近上市的AJ1102株抗原含量更是高达107.5TCID50/mL。

2.2 弱毒疫苗

当前已有9家企业生产的3种PED商品化弱毒疫苗,分别为:TGE-PED-RoV(弱毒华毒株+弱毒CV777株+NX株)三联弱毒苗,TGE-PED(弱毒WH-1株+弱毒AJ1102株)二联弱毒疫苗和TGE-PED(HB08株+ZJ08株)二联弱毒疫苗。

PEDV、TGEV和RoV都是经消化道感染,具有非常明显的肠组织嗜性。对肠绒毛上皮细胞的侵染,引起肠绒毛上皮细胞的萎缩脱落,从而造成感染猪只的消化功能紊乱、酸中毒和脱水。因此,在肠腔内阻断腹泻病毒感染是最直接和有效的方法。在防疫中起主要作用的抗体是循环抗体(IgG)和分泌型黏膜抗体(sIgA)。IgG的主要作用是用来抵御全身感染,而sIgA主要用来抵御黏膜感染。

IgG的分子量较大,不容易穿过肠壁进入肠腔,它们对胃酸和消化酶的抵抗力较差。sIgA也叫分泌抗体,分子量较小,它们在黏膜免疫中起主要作用,可以抵御胃酸和消化酶的消化,并且与肠黏膜有亲和作用,所以IgA在肠道中起重要的作用。研究表明,母源sIgA的水平与仔猪对PEDV感染抵抗力有关,而血液中的中和抗体与其对新生仔猪的保护作用没有相关性。因此,对于养殖场如何防控PEDV感染,除严格的生物安全外,首先要刺激动物机体产生特异性的高效价的sIgA抗体,是疫苗免疫的关键。

2.3 基因工程疫苗

新型疫苗的种类很多,包括重组活载体疫苗、核酸疫苗、转基因植物疫苗、亚单位疫苗等。目前已知制备的核酸疫苗仅在小鼠体内证明可产生抗体或诱导体液免疫。有报道将PEDV S1基因构建的重组腺病毒能稳定地表达PEDV S1蛋白,为PEDV口服疫苗的研究提供了新的思路。人们还采用哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞表达系统等真核表达系统研制了针对腹泻病毒的亚单位疫苗,但在临床使用上需要非常大的剂量才能达到有效的保护。

目前基因工程疫苗少有商品化的,大多处于研发或试验阶段。基因工程疫苗具有制备简单、免疫效果强、免疫应答持久等优点,但是同时存在潜在的一些危险,如发生自身免疫或者免疫耐受等,植物疫苗表达的蛋白是否会被动物胃肠道所消化吸收或者失活的问题。

3 腹泻的临床防控效果

3.1 不同疫苗类型的防控效果

当前病毒性腹泻主要引起10日龄以内仔猪的严重发病和死亡,因此,如何给仔猪提供有效保护是疫苗研发的关键所在。由于主要病原为PEDV和PDCoV,目前还没有PDCoV的疫苗上市,因此,做好PEDV的免疫保护是对当前腹泻防控的关键。尽管疫苗的使用普及率很高,但以PEDV为主要病原引起的腹泻疫情依然持续存在。

目前,绝大部分临床流行毒株均为变异株PEDV,其与疫苗株在S基因上的差异可能是导致基于CV777疫苗株免疫效果不好的原因。因此,创制PEDV流行株的疫苗对于猪流行性腹泻的防控是势在必行的,当前基于流行毒株AJ1102制备的疫苗在临床的防控效果值得关注。

灭活苗与弱毒苗的特点使得两种苗的保护效果存在较大差异。使用灭活苗免疫母猪在血清和初乳中主要是IgG抗体,且乳汁中IgG浓度随着哺乳日龄迅速下降,对仔猪的保护有限。IgG的主要作用是用来抵御全身感染,而IgA可抵御消化道感染。接种弱毒苗后病毒可在体内细胞上增殖,刺激机体产生IgG和IgA,从而全面保护猪只,特别是使通过母乳被动免疫的新生仔猪免受病毒感染。

因此,从疫苗免疫上看,弱毒疫苗的免疫效果要好于灭活疫苗。相比弱毒疫苗,灭活苗免疫产生抗体时间慢,而且只能诱导体液免疫;而弱毒疫苗产生抗体快,相比灭活苗产生免疫保护时间短,免疫保护力高。但从免疫持续期看,灭活苗要比弱毒疫苗长,受抗体干扰小。因此,在防疫过程中,特别是清群净化阶段或提高免疫持续期,使用灭活苗会是不错的选择。

临床发现,初产母猪往往发病率高于经产母猪,初产母猪所产仔猪的发病率和死亡率也往往高于经产母猪所产仔猪的发病率和死亡率;这在于初产母猪自身产生的腹泻免疫力较弱,体内未产生足够高腹泻抗体,不足以给仔猪提供母源性保护。

3.2 母乳被动免疫是保护新生仔猪的关键

由于此次病毒性腹泻主要引起10日龄内新生哺乳仔猪的高发病和高死亡,如何使新生仔猪获得保护力是防控的关键。新生仔猪感染腹泻病毒的主动免疫存在主要问题为:1)在阳性母猪群,母源抗体干扰口服弱毒疫苗诱导的免疫保护;2)新生哺乳仔猪免疫系统不成熟;3)需要3周的时间才能产生抗体,但PEDV的高毒力和早期感染使得仔猪不具备自身产生抗体来抵抗感染。因此,通过接种疫苗对仔猪进行主动免疫来保护新生仔猪免受感染和发病在临床上不可行,被动的母乳免疫是其获得可能保护的有效手段。

因此,在怀孕母猪黏膜部位诱导产生的免疫应答,通过初乳和乳汁被动转移给仔猪,提供给仔猪肠道感染的直接保护作用至关重要。先前对于TGEV被动免疫的研究表明,感染TGEV康复的母猪能够提供给其后代猪群针对TGEV感染的保护,这种保护与乳汁中高水平的抗体息息相关。因此,以免疫过母猪的乳汁被动免疫保护新生哺乳仔猪被感染是最有效和可行的方法。

实际上,为了促进仔猪的健康,每一个仔猪出生后必须尽早吃初乳。因为初乳中大量的IgG和IgA在被仔猪摄取1h后可以通过小肠吸收,这称为“肠封闭”,为了获得大量的IgG和IgA,每1头小猪必须在出生2h内中摄取到初乳。这是因为在大约2h左右,母猪初乳中IgG和IgA的量达到最高水平,这个水平能持续6h,此后乳中IgG和IgA的数量急剧下降。因此,尽早让新生仔猪吃到初乳,且吃到充足的初乳是仔猪抵抗腹泻病毒感染的关键。

3.3 不同免疫方法的临床效果

临床上虽然使用了较多的疫苗,但腹泻的发生仍然态势严峻。免疫方法的不同可获得不同的结果。在未发生过腹泻的猪场,单纯的免疫灭活苗或弱毒苗都未能在腹泻暴发时保持较好的抵抗力,而往往是需要将弱毒苗与灭活苗结合使用才能获得较好的保护力。因为单纯的免疫灭活苗经非口途径免疫不能诱导黏膜免疫,在血清和初乳中主要是系统性的IgG抗体占主导地位,其在乳汁中很快下降,提供给仔猪微不足道(很小)的乳汁免疫。

在免疫母猪所产仔猪TGEV攻毒保护研究中,如果疫苗在母猪肠道中诱导主动免疫失败,母猪发病,表现腹泻或食欲减退和停止乳汁产生,哺乳仔猪表现高死亡率。因此,诱导有效黏膜免疫的TGEV或PEDV母源疫苗对于保护母猪肠道是至关重要的。而单纯的免疫弱毒株免疫母猪较强毒株免疫母猪产生较低的乳汁sIgA抗体水平和仔猪保护率,导致差异原因包括疫苗中较低的病毒量和胃肠道稳态的丧失,以及病毒致弱后在母猪肠道复制能力。

临床上还发现,暴发过腹泻的猪场,特别是母猪发生腹泻的猪接种灭活苗的防控效果较好。究其原因是暴发的过程相当于自然感染或口服病毒,能够很好地诱导肠道黏膜免疫,再接种灭活苗后能够进一步刺激产生更高水平的抗体,特别是IgG,以提供全身性免疫。基于此经验,有很多的养殖场尝试采用人工感染的方法——即返饲,然后再结合疫苗来进行防控。

有学者比较了返饲、疫苗接种与返饲+接种疫苗后母猪血清及乳汁中抗体水平差异,发现提前感染可促进疫苗免疫后抗体的产生。在产前6周和3周分别注射PEDV RNA疫苗,不管是后备母猪还是经产母猪的血液和乳汁中只有低水平或可忽略的IgG和中和抗体滴度;产前4个月返饲可从乳汁中检出高滴度的中和抗体,但未从血清中检出IgG;在进行连续3d返饲的种猪母乳和血清中均可检出IgG和中和抗体;而在返饲+接种疫苗的猪群中均有高滴度的血清IgG和乳汁中和抗体,且经受住了一次PEDV暴发。

据此可知,经口暴露或口服免疫能很好地促进乳汁中高滴度中和抗体的产生,这可为以母乳获得被动免疫的新生哺乳仔猪提供很好的保护。

但返饲存在较多的风险:1)返饲的剂量大小对返饲效果和副作用之间的平衡是临床上非常难把握的,剂量小了猪只不腹泻,达不到返饲的目的;剂量大了可能造成母猪流产肠内病毒载量过高而导致大面积腹泻。

2)发病猪除了感染了腹泻病毒,还可能携带其他的病毒,如伪狂犬病毒、猪蓝耳病病毒或圆环病毒等,伴随着返饲这些病毒可在全场传播,从而可能造成新的疾病出现。因此,返饲是一种风险较高的手段,需要结合实验室评估以获得准确腹泻病毒定量以及排除其他可能的传染性病原后才可实施。
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