1株H3N2亚型猪流感病毒的分离鉴定、基因序列分析及其致病性评价
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摘要：采集猪流感(swineinfluenza,SI)疑似病猪的鼻拭子样品，经RT-qPCR检测H3亚型猪流感病毒(swineinfluenzavirus,SIV)，将阳性样品接种SPF鸡胚进行病毒分离，对分离到的H3N2亚型SIV进行全基因组测序及序列分析，并对其致病性进行研究。结果表明，成功分离到1株SIV，经分型RT-PCR鉴定为H3N2亚型,命名为A/Swine/YunNan/KM/06/2023(H3N2)，简称SIV H3N2KM株。全基因组序列BLSAT比对结果显示，SIV H3N2KM株的8个节段分别与8个不同毒株的猪源或人源流感病毒的同源性最高，分别为95.41%~97.49%，其中HA和NA节段来源于H3N2亚型SIV，NP节段来源于H1N1亚型人流感病毒，M节段来源于H1N2亚型SIV，其他节段均来源于H1N1亚型SIV。HA蛋白的关键受体位点(190D、223V、226I、228S)未发生改变。致病性试验结果显示，感染组仔猪出现体温升高、喷嚏、流鼻涕等症状，可通过鼻腔向外界排毒，剖检后肺脏产生不同程度的肉样实变，免疫组化结果显示，病毒可在肺脏中大量复制。综上，本试验成功分离到1株H3N2亚型SIV，并对该病毒的基因遗传演化、分子特征和致病性进行了研究，揭示了H3N2亚型SIV在不断地发生演变，分离株对仔猪具有致病力，为我国SIV流行情况的监测和SI防控提供了参考依据，并为SI疫苗研发提供了候选毒株。
关键词: 猪流感病毒;H3N2亚型;分离鉴;序列分析;致病性
猪流行性感冒(swine influenza，SI)简称猪流感，是由猪流感病毒(swine influenza virus，SIV)引起的一种急性、接触性传染的猪呼吸道疾病。仔猪感染SIV的发病率高，感染猪群短时间内可相继发病，主要出现发热、食欲不振、打喷嚏、严重时出现呼吸困难等呼吸道症状。猪单独感染SIV的死亡率比较低，发病期间若混合感染其他病原会导致死亡率骤增，进而对养猪业造成较大的经济损失。目前，世界范围内已报道过多种亚型SIV在猪群中流行，包括H1N1、H1N2、H3N2、H5N1、H7N7及H9N2等亚型，其中H1N1、H1N2、H3N2为主要流行亚型。猪的呼吸道上皮细胞内同时具有SAa-2,3 Gal和SAa-2,6 Gal受体，使其成为禽流感病毒、猪流感病毒、人流感病毒的共同易感宿主，并成为不同亚型流感病毒基因重组、基因变异以及跨种属传播的天然“混合器”。如果猪流感出现地区流行或大流行，可能会对人类造成威胁，因此对猪流感病毒的流行情况进行持续监测具有重要意义。本研究从云南省昆明市一规模化养猪场疑似SI病猪的鼻拭子样品中成功分离到1株H3N2亚型SIV，对分离株进行全基因测序和遗传进化特征分析，并评价了该毒株对仔猪的致病性，为监测SIV在我国的流行情况以及SI疫苗的研制提供支持和参考。1 材料与方法
1.1 病料、鸡胚与细胞株 2023年6月从云南省昆明市一规模化养猪场采集疑似SI病猪的鼻拭子，置于5ml拭子液(含100万 IU/L青霉素G钠和1000 mg/L硫酸链霉素的DMEM)中，冷藏运至实验室后置-70℃以下保存。SPF鸡胚购自济南赛斯家禽科技有限公司，孵化至9～11日龄后使用。犬肾上皮细胞系(MDCK)，由华威特(江苏)生物制药有限公司冻存、提供。
1.2 主要试剂 DNA/RNA提取试剂盒(批号：017E2211GA)，购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;一步法RT-PCR试剂盒(24122)，购自江苏康为世纪生物科技股份有限公司;SIV荧光PCR试剂盒(2023001)，购自湖南冠牧生物科技有限公司;SIV H1亚型、H3亚型特异性阳性血清，由华威特(江苏)生物制药有限公司制备提供;0.5%鸡红细胞悬液，由本实验室现用现制。
1.3 实验动物 10～12周龄健康仔猪购自江苏省泰州市一养猪场，经RT-PCR检测为SIV抗原阴性，经血凝抑制试验(HI)检测为SIV抗体<1:10。
1.4 引物合成 参照《GB/T 27521—2011 猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法》合成SIV分型引物(表1)，引物由南京金斯瑞生物科技有限责任公司合成。
1.5 样品检测与病毒分离
从-70℃取出冻存的鼻拭子样品置室温融化，充分振荡后抽取液体转移至其他离心管，取200 μL液体提取核酸后采用SIV荧光PCR试剂盒进行检测。检测为SIV核酸阳性后，将剩余液体以4000 r/min在4℃离心10 min，吸取上清用0.45 μm滤膜过滤除菌后接种9～11日龄SPF鸡胚，0.2 ml/胚。鸡胚置37.0～38.0℃，湿度50%～60%条件下培养72 h，置4℃过夜后，无菌条件下收集24～72 h内死亡和存活鸡胚的尿囊液，分装后置-70℃以下保存。按常规微量血凝试验法，测定尿囊液的红细胞凝集价(HA)。当HA≥1∶8时可做进一步扩大培养并鉴定;若HA<1∶8，可将尿囊液盲传2代，HA仍<1:8时可终止试验。
1.6 病毒的鉴定与命名
按照路伟采用的细胞病毒培养方法，将具有血凝价≥1∶8的尿囊液接种MDCK细胞扩大培养。采用朱向蕾的血凝抑制试验方法，将病毒液与SIV H1亚型、H3亚型特异性阳性血清进行红细胞凝集抑制试验，进行血清学鉴定。按照国标中的方法对收获的病毒液进行SI分型RT-PCR鉴定;将鉴定后的病毒液经超滤、层析等步骤纯化，送扬州大学测试中心进行电镜观察并照相。按照WHO公布的流感病毒通用命名系统进行命名。
1.7 全基因测序
按照DNA/RNA提取试剂盒提取病毒液的RNA，核酸浓度检测合格后采用二代测序技术进行全基因组测序，测序由上海探普生物科技有限公司完成。
1.8 遗传进化和分子特征分析
将病毒8个节段(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS)的测序结果，提交NCBI进行在线BLAST比对，鉴定病毒亚型并对核苷酸同源性进行分析。用MEGA7.0中的邻接法(Bootstrap值设为1000)，将病毒全基因序列与GenBank数据库中收录的参考毒株基因序列进行系统进化分析。利用在线软件(https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetNGlyc-1.0/)预测HA和NA蛋白的潜在糖基化位点。利用MegAlign软件分析SIV H3N2 KM株的HA蛋白关键受体位点的氨基酸变异情况。
1.9 对仔猪致病性试验
筛选10～12周龄健康易感猪(SIV抗原阴性、HI抗体<1∶10)7头，随机选取5头，经气管注射SIV H3N2 KM株病毒液(104.7 TCID50/mL)，4.0 mL/头;剩余2头经气管注射无菌PBS，4.0 mL/头，相同条件下隔离饲养作为阴性对照。攻毒后1～5d，每日定时测温、观察临床症状;攻毒后3～5d，采集鼻拭子样品接种9～11日龄SPF鸡胚培养，鸡胚尿囊液HA≥1∶8时，判为鼻拭子病毒阳性，反之为阴性;攻毒后5d，剖检观察肺部病变，采用28分制评分法评估病变严重程度，取肺脏病变组织进行免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)检测(委托武汉赛维尔生物科技有限公司完成)。
2 结果
2.1 病毒的分离及鉴定 经RT-qPCR检测，采集的17份鼻拭子样品中2份为H3亚型SIV阳性。接种鸡胚并盲传后，1份样品的鸡胚尿囊液HA为1∶32。经MDCK细胞扩大培养后，病毒收获物的HA为1∶128，病毒含量为104.7 TCID50/ml。特异性阳性血清鉴定分离病毒为H3亚型SIV，分型引物鉴定分离病毒为H3N2亚型SIV(图1);透射电镜下可见直径100±20 nm的球形或椭圆形的病毒粒子，具有囊膜，且囊膜表面有许多放射状排列的突起(图2)。根据命名通则，将该分离病毒株命名为A/Swine/YunNan/KM/06/2023(H3N2)，简称SIV H3N2 KM株。
注：M. Trans 2000 Maker;1. H3亚型鉴定;2. 阴性对照;3. N2亚型鉴定;4. 阴性对照。图1 分离病毒的SIV分型引物鉴定结果
图2 分离病毒的电镜图片
2.2 病毒全基因组的同源性比对 采用二代测序技术对分离病毒的全基因组测序，测序结果经BLAST比对显示，SIV H3N2 KM株的8个基因节段分别与不同年份、不同地区的8个流感病毒株相对应基因节段的同源性最高，其中HA、NA基因与H3N2亚型SIV同源性最高，PB2、PB1、PA、NS基因与H1N1亚型SIV同源性最高，NP基因与H1N1亚型人流感病毒的同源性最高，M基因与H1N2亚型SIV同源性最高(表2)。同源性比对结果表明，SIV H3N2 KM株发生了不同流感病毒之间的重组，该毒株由不同种属、不同亚型的流感病毒重组而成。
2.3 全基因组的遗传进化分析 遗传进化树结果显示，SIV H3N2 KM株的HA、NA基因与来自山东的类人H3N2流感谱系(human like H3N2)的A/swine/Shandong/15/2018(H3N2)株的亲缘性最高，遗传进化均处于同一分支(图3a、b)，提示2个基因节段可能来源于山东地区的SI，表明我国的SIV可能存在跨地区远距离传播的现象。内部基因PB2、PB1、PA、NP和M均来源于2009年大流行H1N1谱系(pdm/09 H1N1)，NS基因来源于古典型H1N1谱系(CS H1N1)(图3c~h)。
图3 SIV H3N2 KM毒株的(a)HA、(b)NA、(c)PB2、(d)PB1、(e)PA、(f)NP、(g)M、(h)NS基因的分析遗传进化树
2.4 HA与NA蛋白分子特征分析 根据HA与NA基因核苷酸序列推导出的氨基酸序列，与参考毒株A/New York/55/2004(H3N2)相应蛋白的氨基酸序列的相似性分别为91.45%、93.18%。HA蛋白切割位点的氨基酸序列为PEKQT↓R，不具备连续的碱性氨基酸，符合低致病性流感病毒的分析特征。HA蛋白的关键受体位点未发生改变(190D、223V、226I、228S)，表明其能够结合人流感病毒SAa-2,6-Gal受体。在线软件预测HA蛋白有7个潜在的糖基化位点，NA蛋白有4个潜在的糖基化位点(表3)。
2.5 对仔猪致病性试验 感染组动物攻毒后2～5d出现体温升高(图4)、打喷嚏、流鼻涕等一项或多项症状，攻毒后3～5d感染组仔猪鼻拭子的鸡胚培养物HA均不低于1∶16，表明感染SIV H3N2 KM株的仔猪可通过鼻腔向环境中排毒。攻毒后5d剖检，感染组4头仔猪的肺脏出现斑块状肉样实变(图5)，病变评分最高为11分。IHC结果显示，仔猪感染SIV H3N2 KM株后，病毒可在仔猪肺脏中大量复制增殖(图6)。试验期间，对照组仔猪未观察到异常症状，剖检肺脏未出现病变。研究结果表明，SIV H3N2 KM株对仔猪具有较强的致病力。
3 讨论
SIV在1930年被分离鉴定后，就一直在不断发生变异、重组，猪群中最初感染的H3N2亚型流感病毒是人源H3N2亚型流感病毒。意大利学者研究发现，20世纪70-80年代分离到的H3N2亚型SIV的8个基因节段均与人流感病毒相似，之后开始与猪群中流行的类禽H1N1亚型SIV(EA like H1N1 SIV)中的6个内部基因节段发生重组。2009年甲型H1N1流感在全球范围内大规模流行，之后美国猪群中检测到1种H3N2变异毒株，包含了来自禽流感、人流感和猪流感病毒的基因片段，且含有pdm/09 H1N1毒株的M基因，并于2011年从人群中监测到了该病毒。BOWMAND等研究表明，H3N2 亚型SIV获得pdm/09 H1N1的M基因后可使其更加容易感染人。Lu等在2019年报道了从1个10岁女童的鼻咽拭子中检测到“三源重组 H3N2 亚型 SIV”，其内部基因包含了pdm/09 H1N1的PB2、PB1、PA和NP 基因，表面基因HA和NA来源HL-H3N2谱系。遗传进化分析显示，本研究分离到SIV H3N2 KM株的HA与NA基因节段来源于HL-H3N2谱系，PB2、PB1、PA、NP和M基因来源于pdm/09 H1N1谱系，NS基因来源于CS H1N1谱系，表明该病毒是三源重组H3N2亚型SIV，且由于该毒株获得了pdm/09 H1N1谱系的M基因，其感染人的能力有可能出现增强。
流感病毒的受体宿主范围与病毒表面HA蛋白受体结合位点的氨基酸有着紧密联系，对于H3亚型流感病毒，其HA蛋白的226位和228位氨基酸对影响受体与宿主细胞结合方面起着关键作用，早期人源H3N2亚型流感病毒在226位和228位的氨基酸为L、S，近期人源H3N2亚型流感病毒在这两个位点的氨基酸为I、S。分子特异性分析显示，SIV H3N2 KM株HA蛋白的190位氨基酸为D，226位氨基酸为I，228位氨基酸为S，表明该病毒具有结合人流感病毒受体SA-a-2,6-Gal的能力。流感病毒表面蛋白糖基化位点的变化，有可能会对病毒的抗原性与病毒对宿主细胞的识别产生影响，由此可引起病毒的生物特性产生变化，从而可使病毒逃避宿主免疫。糖基化位点预测结果显示，SIV H3N2 KM株的HA蛋白有7个潜在的糖基化位点，比人流感病毒A/New York/392/2004 (H3N2)减少了4个位点(8NSTA、133NGTS、144NNSF、165NVTM)，比A/swine/Guangxi/978/2017(H3N2)增加了1个位点(38NATE)，与A/swine/Heilongjiang/684/2017(H3N2)的糖基化位点数相同。
方超等从疑似SI发病猪的鼻拭子中分离到1株H3N2亚型SIV，动物回归试验显示对仔猪具有致病性。本研究分离的SIV H3N2 KM株病毒回归动物后，仔猪也出现了发热、打喷嚏、流鼻涕等流感症状，感染猪的鼻拭子可检测到排毒，剖检后肺脏出现实变，IHC显示病毒在肺脏中大量复制增殖。参考路伟建立的SI发病标准， SIV H3N2 KM株感染仔猪后的发病率为5/5，表明该毒株具有较强的致病力。目前，没有直接证据表明SIV病毒具有在人与人之间传播的能力，但近年来人类感染SIV的报道越来越多，因此无论从公共卫生安全还是从保障养猪业健康发展的角度考虑，均应加强猪群中SIV流行情况的监测及致病性研究，降低SI对养猪业造成的损失及由其引发的潜在公共卫生安全。
综上，本研究分离到的1株H3N2亚型SIV并命名为A/swine/YunNan/KM/06/2023(H3N2)，其基因片段来源于H3N2亚型谱系、pdm/09 H1N1谱系、CS H1N1谱系，对仔猪具有较强的致病性。研究结果为我国SIV流行情况的监测以及H3N2亚型SIV的遗传演化研究提供了参考，也为研制H3N2亚型SI疫苗提供了候选毒株。
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