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体外肠道模型研究发酵豆粕对仔猪大肠发酵参数的影响
张益焘 1，2，3，文 婷 1，2，3，钟智康 1，2，3，朱泽欣 1，2，3，吴 凡 1，2，3，廖新俤 1 *
(1.华南农业大学动物科学学院，广东 广州 510642;2.广西大北农农牧食品有限公司，广西 来宾 545708;3.肇庆大北农农牧食品有限公司，广东 肇庆 526300)
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前言
试验旨在应用体外肠道模型研究发酵豆粕对仔猪大肠菌群碳、氮代谢的影响。以饲喂湿、干发酵豆粕组和对照组仔猪大肠内容物作为菌源，在39℃环境下发酵24 h。主要结果如下：与对照组相比，湿、干发酵豆粕组大肠微生物可分别提高丁酸浓度18.39%和15.15%，降低戊酸浓度15.63%和8.33%，提高丁酰辅酶A转移酶基因数量、降低脲酶基因数量，氨气产量较对照组分别降低了29.68%和17.73%。这些都表明了饲喂发酵豆粕改变仔猪大肠菌群后，能干预大肠发酵，提高仔猪大肠菌群碳水化合物发酵、降低蛋白质发酵。
越来越多研究表明，发酵豆粕中含有蛋白酶、益生菌和寡糖等活性成分，被广泛用于仔猪饲料中以提高仔猪生产性能。由于湿发酵豆粕(含水率35%左右)保质期短，容易发霉，不利于保存，因而一般先将湿发酵豆粕置于50～60℃烘干至含水率为10%左右再保存。但是，与干发酵豆粕相比，湿发酵豆粕有更高的可消化性和更多的益生菌，可以更有效地提高仔猪生产性能，吴先华在饲料中添加10%湿发酵豆粕(含水率28%左右)和10%干发酵豆粕(含水率13%左右)，仔猪平均日增重分别提高20.74%和13.33%、粗蛋白消化率分别提高7.76%和5.51%。
体外发酵法是从人类和反刍动物的研究中发展起来的，虽然体外试验不能复制体内的复杂环境，但与体内试验相比，体外发酵的条件更可控，能够准确反映底物被菌源利用的情况。体外发酵技术已成为一种体外模拟动物肠道环境，研究菌源与大肠发酵参数关系的有效手段，被用于模拟动物肠道发酵的研究。
动物的生长与大肠菌群结构息息相关且相互影响。由于肠道环境复杂，仔猪大肠发酵参数的改变是否由饲喂发酵豆粕改变了大肠菌群而引起的，仍未可知。因此，本试验通过体外肠道模型研究饲喂发酵豆粕改变仔猪大肠菌群后对发酵参数的影响，为发酵豆粕提高仔猪生长提供理论支持和生产指导意义。
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材料与方法
1.1 试验材料
枯草芽孢杆菌KC 101、酿酒酵母JM 102和乳杆菌RG 103的有效活菌数分别为1.0×1010 cfu/g、1.0×109 cfu/g和2.5×109 cfu/g。将50 g葡萄糖、516 g超纯水和三种微生物(4 g枯草芽孢杆菌KC 101、2 g酿酒酵母JM 102和2 g乳杆菌RG 103)混合均匀后静置4 h，再与1 426 g豆粕混合均匀后密封于3 L烧杯中，置于35℃生化培养箱中厌氧发酵4 d即为湿发酵豆粕。将湿发酵豆粕置于60℃烘干至含水率为10%即为干发酵豆粕。
选取健康、体重相近的三元杂交(杜×长×大)仔猪(41日龄，13.14±0.22 kg)75头，随机分为3组，即湿发酵豆粕组、干发酵豆粕组和对照组，每组5个重复，每个重复5头猪(3头公猪、2头母猪)。湿发酵豆粕组和干发酵豆粕组分别在基础日粮中添加7.33%湿发酵豆粕和5.00%干发酵豆粕(干物质含量一致)。饲养时间28 d。
饲养结束后，取仔猪的大肠各段内容物混匀后称取20 g，再按1:3比例加入缓冲溶液(60 mL)，用四层纱布过滤到收集瓶中，39℃下持续通入CO2保持厌氧环境，制成体外发酵菌源。称取500 mg饲料于100 mL玻璃发酵罐作为体外发酵底物。
1.2 体外发酵
体外产气技术参照Menke等的方法，具体操作如下。将474 mL超纯水、237 mL常量元素溶液、237 mL缓冲溶液(39℃预热)、0.12 mL微量元素溶液、1.22 mL刃天青溶液混合，持续通CO2气体10 min，加入50 mL还原剂溶液，再持续通CO2至无色，共1 000 mL接种液。将发酵菌源与接种液按照1:2比例混合均匀，即体外发酵液。在称取好发酵底物的玻璃发酵罐中加入30 mL体外发酵液，排尽玻璃发酵罐内的空气后，用止水夹密封，记录初始刻度，置于39℃空气摇床培养箱中以60 rpm的转速培养24 h。第24 小时终止发酵，记录终末刻度。用硫酸吸收液吸收玻璃发酵罐内的氨气，然后将发酵液转移至50 mL离心管并置于冰上停止发酵，分装后置于-20℃冰箱中保存，用于相关指标的测定。
1.3 试验指标
1.3.1 VFA(挥发性脂肪酸)
取24 h体外发酵液1 mL，加入0.2 mL 25%的偏磷酸和0.2 mL 42 mmol/L的巴豆酸后混匀，于4℃离心机中以10 000 rpm离心10 min，取上清液，过0.22 μm的水相滤头，将滤液置于2 mL棕色瓶中，测定乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和总VFA的含量。
1.3.2 功能基因数量
丁酰辅酶A转移酶基因和脲酶基因数量：荧光定量PCR。
1.3.3 脲酶活性
脲酶采用靛酚蓝比色法测定。
1.3.4 总产气量
将玻璃发酵罐发酵的终末刻度与初始刻度相减即发酵24 h的总产气量。
1.3.5 氨气产量
氨气的测定用次氯酸钠-水杨酸分光光度法。
1.4 数据分析
利用Microsoft Excel 16及SPSS 28软件对数据进行处理，用Tukey检验对处理间进行单因素方差分析(ANOVA)。显著水平P值设为0.05，统计结果表示为平均值±标准误(M±SE)。
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结果与分析
2.1 发酵豆粕对VFA浓度的影响
仔猪大肠内容物24 h体外发酵液中VFA浓度见表1。湿发酵豆粕组、干发酵豆粕组和对照组三组间的乙酸、丙酸、异戊酸和总VFA浓度均无显著差异(P>0.05)。湿发酵豆粕组的丁酸浓度显著高于对照组(P<0.05)，干发酵豆粕组的介于两者之间，但差异不显著(P>0.05)。湿发酵豆粕组的戊酸浓度显著低于干发酵豆粕组(P<0.05)，干发酵豆粕组的显著低于对照组(P<0.05)。由于豆粕的发酵产物甘露寡糖和β-葡聚糖不被仔猪的胃和小肠消化，却能促进大肠丁酸的生成，因此发酵豆粕组丁酸含量较高。与对照组相比，湿发酵豆粕组和干发酵豆粕组的丁酸浓度分别提高了18.39%和15.15%，后两组的戊酸浓度分别降低了15.63%和8.33%。
2.2 发酵豆粕对丁酰辅酶A转移酶基因数量的影响
丁酰辅酶A转移酶是丁酸产生的关键酶。由表2可见，湿发酵豆粕组丁酰辅酶A转移酶基因数量显著高于干发酵豆粕组(P<0.05)，干发酵豆粕组的显著高于对照组(P<0.05)。发酵豆粕对仔猪大肠内容物24 h体外发酵液中丁酰辅酶A转移酶基因数量的影响与丁酸的一致(表1)。
2.3 发酵豆粕对脲酶活性的影响
由表3可见，湿发酵豆粕组的显著低于对照组的(P<0.05)，干发酵豆粕组的介于两者之间，但差异不显著(P>0.05)。由于丁酸的产生受脲酶的抑制，在仔猪大肠内容物24 h体外发酵液中，发酵豆粕组的丁酸浓度更高(表1)。
2.4 发酵豆粕对脲酶基因数量的影响
仔猪大肠内容物24 h体外发酵液中脲酶基因数量见表4，湿、干发酵豆粕组的脲酶基因数量显著低于对照组(P<0.05)，湿发酵豆粕组的低于干发酵豆粕组，但差异不显著(P>0.05)。
2.5 发酵豆粕对氨气产量的影响
与戊酸和异戊酸一样，氨气也代表大肠蛋白质的发酵程度。仔猪大肠中绝大部分微生物都能分解底物产生氨气，但产氨能力有强有弱，不同微生物群落结构对底物的利用情况不同，氨气产量也不同。仔猪大肠内容物24 h体外发酵产气情况见表5。湿发酵豆粕组的总产气量和氨气产量均显著低于干发酵豆粕组(P<0.05)，干发酵豆粕组的显著低于对照组(P<0.05)，且湿、干发酵豆粕组的氨气产量较对照组分别降低了29.68%和17.73%。
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讨论
仔猪大肠中的微生物利用未被胃和小肠消化吸收的蛋白质进行厌氧发酵，这种发酵在总体上被认为是对宿主健康不利的一种过程。碳水化合物的分解产物SCFA大多能被肠道上皮吸收发挥各自功能，而大肠微生物降解蛋白质后，降解产物尽管可以被动物体吸收，但大肠中吸收的氮几乎全部从尿中排出，对动物的氮素营养没有贡献。减少大肠蛋白质发酵从而改善动物肠道健康的方法主要有两个：一是减少日粮中蛋白质的摄入，但是降低日粮中蛋白质的摄入往往会降低仔猪生产性能，因此只能通过提高蛋白质消化率的方式减少大肠蛋白质的发酵;二是在日粮中添加益生元或益生菌，利用菌群竞争，通过增强碳水化合物的发酵使更多蛋白质转化成菌体蛋白，从而降低蛋白质发酵。De等通过代谢组学研究发现，益生元和益生菌能增加大肠菌群碳水化合物发酵产物，减少蛋白质发酵产物，使蛋白质发酵转向碳水化合物发酵。
与蛋白质在大肠中的代谢不同，仔猪大肠中短链脂肪酸含量能代表碳水化合物代谢的程度，而几种短链脂肪酸中丁酸是主要活性物质，所以促进仔猪大肠菌群碳水化合物代谢的实质是促进丁酸的产生。由于大肠环境复杂，涉及微生物代谢和肠道上皮的吸收，因而很难准确控制各种营养物质的代谢及转化。但已有许多报道表明，碳水化合物的发酵可以减少来自蛋白质发酵的有毒代谢物(包括氨和酚类化合物)的产生，这意味着大肠菌群碳水化合物的发酵能抑制蛋白质的发酵。碳水化合物在仔猪大肠的代谢可以通过代谢产物的积累和大肠微生物结构、功能的变化影响蛋白质的代谢。Pieper等通过不同来源的碳水化合物和不同含量的蛋白质对仔猪大肠交互作用的研究也表明，碳水化合物在仔猪大肠菌群代谢的增强会使蛋白质分解成碳水化合物代谢的中间产物，而非蛋白质发酵产物。
与干发酵豆粕不同，湿发酵豆粕还含有乳杆菌等微生物，能直接影响仔猪大肠微生物，提高仔猪大肠乳杆菌属相对丰度，进一步提高碳水化合物的代谢、减少大肠蛋白质的发酵，促进仔猪肠道健康。
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结论
利用饲喂发酵豆粕的仔猪大肠微生物作为菌源进行体外肠道模拟试验发现，湿、干发酵豆粕组大肠微生物可分别提高丁酸浓度18.39%和15.15%，降低戊酸浓度15.63%和8.33%，提高丁酰辅酶A转移酶基因数量、降低脲酶基因数量，氨气产量较对照组分别降低了29.68%和17.73%。这些都表明饲喂发酵豆粕改变仔猪大肠菌群后，能干预大肠发酵，提高仔猪大肠菌群碳水化合物发酵、降低蛋白质发酵。
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