研究快报 | 酵母培养增强瘤胃微生物对玉米秸秆的长期发酵以产生挥发性脂肪酸的性能机理研究
研究背景生物质废弃物是世界上资源最丰富的可再生资源之一，其资源化利用对缓解能源危机、改善生态环境具有重要意义。最近的研究发现，能够通过厌氧发酵从生物质废弃物中回收资源以生产挥发性脂肪酸 （VFA）。VFA在生产生物塑料、生物燃料、食品或药物添加剂等有着很高的价值。在生产上，瘤胃微生物已被用作厌氧发酵的接种物，以高效生产 VFA，因此，瘤胃微生物的开发对于生物质废弃物资源化非常重要。酵母培养物 （YC） 是一种“绿色”的生物活性添加剂，由蛋白质、多糖、肽、氨基酸等组成，广泛用于畜牧业。有研究发现，YC 能够显著增加反刍动物瘤胃中的 VFA 浓度，改变 VFA 比率，并提高粗饲料消化率。目前关于瘤胃微生物作为 VFA 生产接种物的研究主要集中在短期性能上，缺乏关于瘤胃微生物超过 120 d 的长期水解和酸化的相关研究。本研究旨在探讨长期瘤胃发酵中 YC 添加的水解和产酸性能、微生物群落和 YC 添加机制，实现长期高效地将瘤胃发酵成 VFA 的可行目标。
图示：酵母
材料与方法
发酵底物的准备。选择玉米秸秆作为生物质废弃物的代表，并用作发酵基质。发酵前，玉米秸秆被粉碎成 20 目颗粒，然后干燥恒重。瘤胃液来源。从三头瘤胃插管的安格斯牛中收集瘤胃液进行接种。分组设计。分为两组，二组均在500 mL 发酵瓶中进行。对照组的每个瓶含有 7.5 g 玉米秸秆 （2.5% w：v）、100 mL 瘤胃液、200 mL 人工唾液和 0.75 g YC；试验组在对照组的基础上，额外添加 0.75 g YC。试验流程。所有发酵瓶在恒温震荡培养箱中，保持温度39 °C 和转速 150 r/min，培养3 d。从第二个发酵周期开始，在完成初始发酵周期后获得的混合物用作瘤胃微生物的接种物。发酵条件与第一次发酵的条件相同。试验共发酵40次，持续120 d。数据收集。测定每次发酵周期前后的发酵物质的pH 、可溶性化学需氧量（SCOD） 、 VFA 和挥发性固体（VS）。收集发酵3 、 15 、 30 、 60 、 90 和 120 d 的固体用于后续的微生物测序分析。
试验结果
VFA产量
YC 的添加显著提高了 VFA 的产量， VFA 平均浓度达到 7.82 g/L。添加 YC 的 VFA 产量达到 0.313 g/g，高于前人报道的玉米秸秆长期瘤胃发酵的 VFA 产量 （0.252 g/g）。此外，添加 YC 的 VFA 产率与其他研究报道的瘤胃半连续反应器的产率 （0.310 g/g） 相当，与以活性污泥作为接种物并进行生物质预处理的厌氧发酵产量相当，而本试验发酵瓶中的生物质发酵时间为 3 d，低于其他研究的8 d。总体上看，YC 添加增加了 VFA 浓度，但 VFA 在长期发酵的早期阶段浓度降低，可能是因为发酵环境不良导致一些关键瘤胃微生物（如普雷沃菌属、纤维杆菌、瘤胃球菌、密螺旋体等）的减少甚至消失而引起的VFA产量降低；同时，在第二发酵循环中，接种物较高的 VFA 浓度可能是 VFA 浓度降低的另一个原因。YC 添加提高了乙酸和丁酸浓度，并显著提高了长期瘤胃发酵中的丙酸浓度，对照相比分别提高了 4.93% 、 30.1% 和 16.4%。YC 添加降低了pH 值，平均 pH 值为 5.86，比对照低 24.4%。发酵的长期影响
YC 添加显著促进了长期发酵中的 VS 去除，平均 VS 去除率为 47.8%，比对照高 16.7%。本试验VS 去除值与其他试验中的瘤胃膜生物反应器中的 VS 去除值 （28.8%–49.6%） 相当 ，并且高于瘤胃半连续反应器 （44.5%）。不过本研究的发酵时间较短，这表明本试验发酵的转化效率高。YC 添加提高了SCOD的浓度，平均 SCOD 浓度 12.5 g/L，比对照高 16.8%。微生物分析
多样性和丰富度。YC 添加降低了细菌的多样性和丰富度。瘤胃微生物在厌氧发酵中对VS 的去除和 VFA的 生成起到明显效果，但它们的多样性和丰度呈显著下降趋势。这可能是因为发酵条件改变导致的，YC 添加会影响某些特定瘤胃微生物的生长，进一步导致微生物多样性和丰富度降低。
群落组成。属水平上，细菌群落包括Prevotella、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Succinicasticum、Treponema、Escherichia-Shigella、Ruminocococus、Pyramidobacter、Papillibacter、Olsenella、Oribacterium 等在内，这些对发酵降解和VFA生成有着重要作用。YC 的添加显著改变了细菌的群落结构，增强水解和产酸细菌的活性，并进一步促进瘤胃发酵，且在长期瘤胃发酵中形成了稳定的细菌群落结构。YC 添加促进了细菌群落中Prevotella, Succinicasticum, Treponema, Olsenella, Pyramidobacter, and Oribacterium的生长。YC 添加显著提高了Prevotella的相对丰度，也促进了Succinicasticum, Treponema, Olsenella, Pyramidobacter, and Oribacterium的生长，这有助于改善瘤胃发酵中的水解与酸化。线性判别分析及关键微生物与环境因素之间的联系
在本试验中，在属水平上共鉴定出 43 个存在差异的属。Succiniclasticum、Olsenella、Synergistes、Oribacterium、Succinivibrio、Butyricicoccus、Coprococcus、Terrisporobacter、Defluviitalea、Macellibacteroides、Schwartzia 和 Acidaminococcus 被确定为添加 YC 的显着差异属。
YC 组乙酸和丙酸浓度与 VS 呈显著正相关，对照组乙酸和丙酸浓度与 VS的减少 呈弱正相关。YC 添加提高了玉米秸秆在长期发酵中的水解效率，进一步促进了 VFA 的产生。YC 组丙酸浓度与Christensenellaceae_R7_group、Lachnospiraceae_NK3A20_group呈显著正相关，丙酸浓度与 Rikenellaceae_RC9_gut_group、Christensenellaceae_R7_group 呈显著正相关。VS的减少 与 YC 组 Rikenellaceae_RC9_gut_group 、 Christensenellaceae_R7_group 、 NK4A214_group 、Papillibacter和 Lachnospiraceae_NK3A20_group 呈显著正相关。乙酸、丙酸和 VS 的减少与对照中的这些属呈弱正相关。瘤胃菌属间也存在有相当复杂的关系，兴趣浓厚的朋友可以阅读原文进行详细了解，这里不再赘述。以上表明，YC 组与长期发酵对照的微生物相关性存在显著差异。YC 添加增加了微生物相关性的复杂性，改变了 Prevotella、Succiniclasticum、Treponema、Oribacterium、Succinivibrio、Butyricoccus、Coprococcus 等的相对丰度，进一步促进了长期发酵系统中 VFA 的产生和 VS 的降低。功能基因表达
本研究共选择了 22 个与 VFA 产生密切相关的功能基因。与对照组相比，YC 添加增加了纤维素和半纤维素水解为丙酮酸的 β-葡萄糖苷酶 （bglX） 、内切葡聚糖酶 （cel）、寡糖还原末端木聚糖酶 （rexA） 、葡萄糖激酶 （GLK） 和丙酮酸激酶 （PK） 的表达。这与本研究中 VS 去除的增加相对应。在丙酮酸转化为乙酸和丁酸的过程中，YC 添加增加了与乙酸产生相关的丙酮酸-铁氧还蛋白 （POR）、2-氧代戊二酸 （oforA）、磷酸乙酰转移酶 （PTA） 和乙酸激酶 （ackA） 的表达，以及与丁酸产生相关的磷酸丁酰转移酶 （PTB） 和丁酸激酶 （BUK） 的表达。在丙酮酸向丙酸的转化中，YC 添加增加了琥珀酸途径中甲基丙二酰辅酶 A 变位酶 （MUT） 、苹果酸脱氢酶 （MDH） 、富马酸还原酶黄素蛋白亚基 （frd） 和四氢叶酸连接酶 （FHs） 的表达，以及丙烯酸酯途径中 L-乳酸脱氢酶的表达。这些基因表达进一步增强了长期发酵中的 VS 去除和 VFA 产生。YC 添加增加了水解和产酸细菌的活性和生长，进一步增强了功能性基因表达。酵母发酵与产生 VFAs 的机制研究
本研究中，随着 YC 的添加，相对丰度明显增加。YC 添加促进了水解和产酸菌的生长，影响了细菌群落功能，并增强了长期发酵中与水解和产酸相关的功能基因的表达。YC 添加增强了与水解相关的 bglX 、 cel 、 rexA 、 GLK 、 PK 以及与 VFA 生产相关的 POR、 oforA、 PTA、ackA、MUT、 MDH、 frd 和 PUB 的表达。这些功能基因的表达与微生物群落的改变密切相关。结论YC 添加提高了 120 d 瘤胃发酵中水解和 VFA 生产的效率，并能够高效发酵玉米秸秆以生产 VFA，产量为 0.313 g/g，高于其他研究的平均值。YC 添加提高了水解和产酸细菌的活性和丰度，尤其是 Prevotella 和 Succinicasticum。同时，一些低丰度属，如 Synergistes、Oribacterium、Succinivibrio、Butyricoccus、Coprococcus 等，可能对促进 VS 去除和 VFA 产生很重要。添加YV增强VFA产量的机制归因于细菌群落、细菌相关性和功能的改善，以及与水解相关的 bglX 、 cel 、 rexA 、 GLK 、 PK以及与 VFA 产生相关的 POR 、 OFORA、 PTA、 ackA、MUT、 MDH、 frd 和 PUB 的表达增加。
了解更多请阅读原文献：
https://doi.org/10.1016/j.aninu.2024.05.004
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