颠覆传统，北京森康新技术新方案可实现一个世代净化禽白血病！
（二）禽白血病传统净化检测
技术优缺点与净化方案的利弊
2024
「北京森康生物技术开发有限公司」
Beijing Scenk Biotechnology Development Co., Ltd.
创新
规范
高效
Beijing Scenk Biotechnology Development Co., Ltd.
鸡群中发现禽白血病已有一百多年历史了，最初是经典的A、B、C、D亚群白血病。由于采取了严格的净化措施，从1987年以后国际发达国家的大型种鸡公司中就已宣布将外源性鸡白血病毒净化了。但我国从来没有对禽白血病采取过净化措施，因此我国地方品系鸡群中可能一直存在着经典鸡白血病。只不过由于饲养规模小，看不出危害。
1988年，英国从白羽肉用型鸡中发现了新的J亚群禽白血病，它的肿瘤发病率比经典的要高得多。在几年内传遍全世界几乎所有白羽肉用型鸡群，我国在引进白羽肉用型种鸡时也就同时引进了J亚群禽白血病，对我国家禽产业造成的损失巨大，使得我国开启了禽白血病净化之路，实验室检测技术的应用与净化方案的实施，一定程度上使得我国禽白血病的流行率降低，并实现了部分企业禽白血病净化。
本期带来我国在净化禽白血病过程中应用的传统检测技术的优缺点与净化方案存在的利弊。
01
禽白血病主要检测技术
目前控制ALV传播的最有效手段是净化，而检测技术是实现净化的重要技术支撑，常用的禽白血病检测技术如下：
传统禽白血病检测技术优缺点
1
病毒分离鉴定
病毒的分离鉴定是传统的、也是公认的检测家禽是否感染ALV的可靠方法。通常采取发病鸡或可疑鸡的胎粪、泄殖腔拭子、血液、血清、精液、肿瘤组织和蛋清等，处理后，接种CEF细胞或DF1细胞上，增殖培养7～9天。由于大多数ALV接种细胞后，不能产生细胞病变，通常需要收获培养物后，再借助酶联免疫吸附试验（ELISA）、聚合酶链式反应（PCR）和RT-PCR和间接免疫荧光试验（IFA）等方法检测ALV，并进行ALV的亚型鉴定。
2
P27-ELISA (ALV 群特异性抗原 ELISA)
将针对ALV-P27蛋白的特异性捕获单克隆抗体固定于固相载体包被板上，加入样品反应，样品中的抗原与包被板上的抗体特异性结合；随后加入酶标单克隆抗体，与抗原反应，样品中的抗原被反应板上的抗体和酶标抗体夹在中间，形成夹心抗原抗体复合物；随后加入底物溶液进行反应，利用底物显色，通过酶标仪测定吸光度，利用S/P值进行结果判读，颜色的深浅与待检抗原的量成正比，是目前ALV监测与净化主要的检测方法。
3
传统 qPCR
利用实时荧光PCR技术，针对群特异性抗原ALV-P27蛋白基因或亚群特异性抗原ALV-gP85基因进行引物与探针的设计，分别通用检测禽白血病毒和亚群分型。可以利用荧光PCR检测ALV前病毒DNA，也可通过反转录荧光 PCR (RT- qPCR)检测ALV病毒RNA。
4
胶体金检测ALV抗原
胶体金免疫层析技术检测ALV抗原，是以胶体金作为示踪标志物，采用双抗体夹心法测抗原的检测原理。通过标记1株针对ALV-P27蛋白的特异性单克隆抗体固定于试纸条的结合垫，另一株抗ALV-P27蛋白的单克隆抗体包被于NC膜的T线上，抗小鼠的IgG包被于NC膜的C线上。待检样品中如果存在ALV抗原，样品就会与结合垫中的单抗结合，形成抗原抗体复合物，随着层析泳动，抗原抗体复合物与NC膜上T线处的另一株单抗结合，胶体金聚集于此，出现特异性免疫显色反应，未结合抗原的金标单抗与NC膜上C线处的抗小鼠的二抗结合，胶体金聚集于此，出现特异性免疫显色反应。
5
ALV抗体检测
将禽白血病病毒亚群gp85蛋白抗原包被在96孔ELISA反应板上，加入被检样品后，特异针对禽白血病病毒亚群gp85蛋白的抗体就会与包被板上的抗原反应，形成抗原抗体复合物。经过洗液洗掉没有反应结合的血清样本，然后在反应孔中加上酶标二抗，最后将没有结合的酶标二抗洗掉，并加酶催化反应的底物，显色强度与被检样品中禽白血病病毒亚群抗体的含量直接相关。
02
传统禽白血病净化方案的摸索与实施
1、借鉴发达国家禽白血病净化经验
国际主要家禽育种公司曾采用的禽白血病净化检测指标：血浆病毒分离、胎粪P27抗原检测，肛门棉拭子P27抗原检测，蛋清P27抗原检测。
国外禽白血病检测净化技术方案:
（1）1日龄雏鸡：胎粪P27抗原ELISA检测，淘汰阳性雏鸡。
（2）选育日龄：血浆DF-1细胞分离/泄殖腔拭子P27抗原ELISA，阳性淘汰。
（3）母鸡开产前：血浆DF-1细胞分离/泄殖腔拭子P27抗原ELISA，阳性淘汰。
（4）母鸡开产初期：血浆DF-1细胞分离/初产蛋2-3枚P27抗原ELISA，阳性淘汰。
（5）母鸡开产中期：蛋清P27抗原ELISA/泄殖腔拭子P27抗原ELISA，阳性淘汰。
2、我国传统主流的禽白血病净化方案
通过借鉴发达国家成功净化禽白血病的经验，根据不同品种/品系鸡禽白血病排毒规律特点、试验不同检测技术和不同样品类型的适用性与可靠性比较、结合降低内源性病毒干扰的检测方法，我国禽白血病净化专家摸索出了一套适合我国种禽场禽白血病净化的参考技术方案，形成以胎粪和蛋清P27抗原ELISA检测；血浆和公鸡精液病毒分离+P27抗原ELIA检测为主要技术的过程。同时也相继形成了种禽场禽白血病净化方案的国家标准、地方标准和行业标准。通过该净化技术方案的实施，很多大型的种禽育种公司，通过大量的坚持投入和多个世代的持续净化，已经实现了白羽肉鸡、黄羽肉鸡和蛋鸡禽白血病的净化工作。
我国禽白血病主流的检测净化技术方案：4个主要检测节点，4种检测样品，2种检测方法。
01
1 日龄雏鸡胎粪检测
节点选择优点
（1）经母体垂直传播的禽白血病病毒在胚胎的胰腺大量复制，随雏鸡胎粪排出，病毒载量较大、传染性强。
（2）雏鸡出雏后，需翻肛性别鉴定，便于同时胎粪采样检测。
（3）此时淘汰阳性雏鸡，节约养殖成本，经济损失更小。
（4）1日龄胎粪的内源性病毒/抗原表达量整体相对于较大日龄雏鸡的泄殖腔拭子要低，此时检测，可以减少P27-ELISA检测的假阳性率。
节点剔除缺陷
（1）仍然有较多的雏鸡内源性禽白血病抗原表达量较高，P27-ELISA检测为假阳性， 存在误杀，造成损失。
（2）仍然有较多的雏鸡垂直传播外源性病毒的载量较低，P27-ELISA检测为假阴性， 存在漏检，导致带毒雏鸡进一步进行水平传播。
（3）ELISA方法敏感性低，胎粪不能合样检测，胎粪检测还需要进行反复冻融的前处理，检测工作量巨大，劳动强度大，时间紧，需要大量的人员配备。
（4）“漏检”与“误诊”并存，增加后续净化周期和净化成本。
02
6-10 周龄育成鸡检测
节点选择优点
（1）6-10周是禽白血病排毒一个高峰期，相对容易采集到较高比例阳性的排毒鸡。
（2）较低病原载量的外源病毒可以通过DF-1细胞进行增殖+P27-ELISA检测阳性剔除。
（3）一定程度的内源性病毒干扰，可以通过结合DF-1细胞进行病毒分离+P27-ELISA 检测阴性排除。
（4）病毒分离方法特异性高，结合 P27-ELISA 检测结果可靠性相对较强。
节点剔除缺陷
（1）逐只鸡采集血浆，工作量大，对鸡应激反应较大，排毒并不一定同步有病毒血症，采不到阳性样品， 导致检测的假阴性。
（2）内源性病毒/抗原虽然不在DF-1细胞上增殖，样品中内源性表达量高的，通过后续P27-ELISA依然可以检测到细胞培养液中P27抗原阳性，检测假阳性，导致误杀。
（3）病毒分离受到各种因素影响分离效果，影响检出率；即便分离效果好，大多病毒不产生细胞病变，利用 ELISA检测，ELISA敏感性低，依然检测为阴性。
（4）即使结合病毒分离的方法，“漏检”与“误诊”依然并存，同样增加后续净化周期和净化成本。
03
18-20 周龄开产检测
节点选择优点
（1）18-20周开产初期，母鸡开产应激导致排毒，采集开产前三枚蛋清检测。
（2）输卵管的蛋清分泌部向蛋清中排毒量高，采集蛋清检测容易检测到阳性鸡。
（3）蛋清内源性干扰相对较少，蛋清 ELISA与病毒分离对应性较强。
（4）公鸡精液也是重要的传染源，需要采集公鸡精液进行检测。
节点剔除缺陷
（1）蛋清样品吸取进行病毒分离+ELISA检测，可操作性较差，费时费力。
（2）蛋清依然是有内源性干扰存在，ELISA检测结果，取决于内源性抗原表达量高低。
（3）蛋清中依然会有低病原载量的外源病毒排毒， ELISA 检测会出现漏检。
（4）公鸡可能处于病毒血症时期（持续性 /一过性），但精液中未必排毒；精液排毒， 血液未必处于病毒血症，公鸡精液直接ELISA，假阳性较高，需进行病毒分离。精液病毒分离效果较差，存在假阴性。
04
40-45 周龄继代留种前检测
节点选择优点
（1）继代留种前，检测种鸡是否带毒，剔除阳性鸡，防止垂直传播下一世代。
（2）检测母鸡血浆和种蛋蛋清，是否留作种用，检测阳性进行阳性鸡的剔除。
（3）检测公鸡的血浆和精液，是否留作种用，血浆和精液任一阳性，进行阳性鸡的剔除。
（4）病毒分离+P27-ELISA，相对较高的敏感性和特异性。
节点剔除缺陷
（1）蛋清样品吸取进行病毒分离+P27-ELISA检测，可操作性较差，费时费力。
（2）蛋清依然是有内源性干扰存在，P27-ELISA检测结果，取决于内源性表达量。
（3）病毒分离受到各种因素影响分离效果，影响检出率；即便分离效果好， 大多病毒细胞不产生病变，利用P27-ELISA检测，敏感性低，假阴性。
（4）“漏检”与“误诊”并存，增加后续净化周期和成本。
3、传统主流的禽白血病净化方案：P27-ELISA和病毒分离净化了哪些鸡只？
01
胎粪检测
淘汰：A/B/J/K亚群病毒载量高的雏鸡与内源性反转录病毒载量高的雏鸡。
漏网：A/B/J/K亚群病毒载量低、极低的雏鸡。
02
蛋清检测
淘汰：A/B/J/K亚群病毒载量高的蛋清对应的母鸡与内源性反转录病毒载量高的蛋清对应的母鸡。
漏网：A/B/J/K亚群病毒载量低、极低的蛋清对应的母鸡。
03
病毒分离+P27-ELISA检测
淘汰：血浆中A/B/J/K亚群病毒载量高、较低的鸡；精液中A/B/J/K病毒含量高的公鸡血浆中内源性反转录病毒载量高的鸡。
漏网：血浆中A/B/J/K亚群病毒含量极低的鸡；精液中A/B/J/K病毒含量低、极低的公鸡。
03
下期预告
鉴于传统的禽白血病净化检测技术的缺点与净化方案存在的弊端，使得禽白血病的净化进程缓慢，投入大，周期长，采样与检测过程繁琐等因素，影响净化效果。下一期即将推出北京森康生物基于禽白血病病毒荧光RT-PCR方法的检测净化新技术与新方案的临床验证与应用，可实现一个世代净化禽白血病的检测净化新方案，敬请期待！
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